方 法 验  证

湖州药检所 王新财

一、微生物检查方法的验证

1、 细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证

1.1  验证的目的：确保试验方法的完整，保证检验结果的可靠。

1.2  何时需要验证：a、建立微生物检查方法时。

                   b、药品的组分或原检验条件发生改变时。

1.3 验证菌种

(1)大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC(B) 44102] ；

(2)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]；

(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]；

(4)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001] ；

(5)黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003] ；

该5种菌株具有普遍的代表性，5种菌分别代表不同的微生物类别，（1）（2）（3）属细菌，（4）真菌，（5）霉菌。验证所用的标准菌种的传代数不得过5代。省所提供的是第2代，我所提供的是第3代。

1.4菌液制备

1.4.1制备  

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中，32.5±2.5℃培养18~24小时；白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，25.5±2.5℃培养24~48小时；上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液逐级稀释制成50-100cfu/ml的菌悬液。

黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁培养基斜面上，25.5±2.5℃培养5~7天，使大量孢子成熟，加入3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，无菌纱布或薄棉滤过，逐级稀释至50~100cfu/ml的菌悬液。

1.4.2注意点

a、菌悬液配制的稀释过程中，每一级稀释液混合震荡必须非常充分。

b、由于菌种为具有特殊活性的生物，菌种的状态、接种量及培养时间对最终菌悬液配制浓度都有较大影响，因此在试验中应严格按照已确定的实验参数（接种量、培养温度、培养时间、培养基的量）。                                

      c、制备好的原菌悬液以当天使用为宜，超过一周应重新计数。

      d、自我保护，防止感染。

1.5方法 

1.5.1平皿法

    对无明显抑菌作用的水溶性制剂，采用该方法进行微生物限度检查法的验证。方法验证的主要思路：加菌回收。

   ⑴试验组：取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和浓度为50~100cfu/ml的菌液1ml，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每种试验菌制备2个平皿，培养，计数。

   ⑵菌液组：测定所加的试验菌数，即上述菌液1ml注入平皿，倾注琼脂培养基，每种试验菌制备2个平皿，培养，计数。

⑶供试品对照组：测定供试品本底菌数，即加上述供试液1ml，倾注琼脂培养基，培养，计数。

   验证试验至少应进行3次独立的平行试验，各菌应逐一进行验证，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

试 验 组的菌 回 收率%=

  试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数

                                                                 ×100%

          菌液组的平均菌落数

   试验组的菌回收率均不低70%，确定可以照该供试品制备法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌数。若任一次试验中试验组的菌低于70%，应采用其他方法重新进行验证。

1.5.2培养基稀释法

略带抑菌作用的水溶性制剂（上述常规平皿法试验菌回收率低于70%的），可采用该方法进行方法验证。

⑴试验组：

a、准备25个平皿，分5组，每组5个平皿，分别做好各相应菌种的标记。

b、取试验可能用的最低稀释级供试液各0.2ml，分别注入上述平皿中，即每组加1ml供试液。

c、按标记分别注入浓度为50~100cfu/ml的菌液1ml，立即倾注琼脂培养基，培养，计数，取平均值。

    ⑵菌液组：测定所加的试验菌数，同1.5.1⑵。

⑶供试品对照组：测定供试品本底菌数，即上述供试液1ml，5等分，分别注入5个平皿中，倾注琼脂培养基，培养，计数。

试验组的菌回收率计算同平皿法。

注：上述培养基稀释法是将1ml供试液用5倍稀释液来培养，亦可用2倍稀释液、10倍稀释液来培养，即每皿加供试液0.5ml、0.1ml。

1.5.3薄膜过滤法

一般适用于对可溶性抑菌制剂。主要思路：滤除抑菌成分，加菌回收。

⑴试验组：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，滤过，稀释剂冲洗数次，在最后一次冲洗中加入50~100cfu/ml试验菌1ml，滤过，按薄膜过滤法计数。

⑵菌液组：测定所加的试验菌数，同1.5.1⑵，无需过滤。

⑶供试品对照组：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，滤过，稀释剂冲洗数次，按薄膜过滤法计数。
     ⑷稀释剂对照组：用相应得稀释液替代供试品，加入1ml上述菌液，滤过，稀释剂冲洗数次，按薄膜过滤法计数。

试验组的菌回收率同1.5.1 平皿法。

稀 释 剂 对 照 组 菌回 收 率 % =

稀释剂对照组的平均菌落数

×100%                                           

      菌液组的平均菌落数

3次验证试验，各菌的试验组的菌回收率、稀释剂的菌回收率均不低于70%，该方法可行，确定可以照该制备法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌数。

注意点：

a、供试品的量一般按每张滤膜1g或1ml供试品的加入。

b、稀释剂冲洗次数和冲洗量应根据供试品的性质和实际情况而定，冲洗次数一般不少于3次，总共冲洗量一般不大于1000ml，个人认为少量多次较好。

c、稀释剂对照组考察的是供试液制备和处理过程中微生物受影响的程度，所以所加试验菌应参与整个制备和处理过程。

d、选择适宜的滤膜。

e、所使用的与供试品或稀释剂直接接触的所用用具都应灭菌处理，操作过程防止滤膜被污染。

1.5.4 离心沉定集菌法

主要思路：离心沉定，离心集菌。

试验组：离心得供试液，加菌，采用适宜方法计数。

菌液组：测定所加的试验菌数。

供试液组：离心得供试液，同法计数。

稀释剂对照组：稀释剂代替供试品，加菌（菌液应参与离心处理），处理过程同供试液组。

考察各菌的试验组的菌回收率、稀释剂的菌回收率均不低于70%。

1.5.5 中和法

   主要思路：制备供试液过程中加入适宜的钝化剂、酶等中和剂，以消除或减小制剂中的抑菌性。

   中和剂的量应多次试验而定。

   稀释剂对照组考察中和剂本身的抑菌性和处理过程对微生物的影响。

   考察各菌的试验组的菌回收率、稀释剂度对照组的菌回收率均不低于70%。

1.6 讨论

a、供试品需要分散、乳化等特殊处理的均应考察考察处理过程对微生物检出的影响，即均应考察稀释剂对照组的回收率。

b、有时单独一种方法不能消除供试品的回收率，可多法联合使用。

c、验证方法至少应进行3次独立的的平行试验，这是对验证方法本身重复性的考察。

d、验证试验可以与供试品的细菌，霉菌及酵母菌计数同时进行。

e、国内外验证用菌株比较如下：

各国

药典

       CP

       BP

      USP

       JP

菌株

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠球菌

黑曲霉

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

白色念珠球菌

枯草芽孢杆菌

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠球菌

黑曲霉

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

沙门菌

加入菌量（cfu)

50~100

100

105-106

103

检验方法

中和法

平皿法

稀释法

离心沉淀法

薄膜过滤法

中和法

平皿法

稀释法

薄膜过滤法

中和法

平皿法

稀释法

薄膜过滤法

平皿法

稀释法

平板表面涂抹法

薄膜过滤法

2 控制菌的验证

2.1  验证的目的同1.1。

何时需要验证同1.2。

2.2 验证菌种

    (1)大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC(B) 44102] ；

(2)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]；

(3)乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi)[CMCC(B) 50094];

(4)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]；

(5)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]；

验证时，依照各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌。

2.3菌液制备

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，32.5±2.5℃培养18~24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10~100cfu的菌悬液。

2.4验证方法

⑴试验组：取规定量供试液（各控制菌检查方法下均有规定）及10~100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应的控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，试验菌液应加在最后一次冲洗液中，冲洗后，取出滤膜接种到增菌培养基中。

⑵阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌的检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时得阴性对照菌采用大肠埃希菌。

结果判断：阴性菌对照组不得检出。若试验组检出试验菌，证明可按此供试液制备方法和控制菌检查法进行控制菌检查。若试验组未检出试验菌，应消除供试品种的抑菌活性，方法同细菌、霉菌和酵母菌检查方法验证（稀释法、薄膜过滤法、中和剂、沉定法），建立新的方法，重新验证。

2.5讨论：

a、供试液制备用薄膜过滤法时，稀释剂冲洗次数和冲洗量不一定与计数法验证相同，应以试验组检出为准。

b、阴性菌对照组的定义（非阴性对照），意义。

c、验证试验可以与供试品的控制菌检查同时进行。

二、无菌检查法的验证

1、 验证的目的：试验方法的完整和结果可靠性。

验证主要思路：供试品+试验菌呈阳性。

2、菌种

  (1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]；

  (2)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10104]；

(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]；

(4)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]

(5)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001] ；

(6)黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003] ；

3、菌液制备

同上，最终逐级稀释至小于100cfu/ml的菌悬液。

4、验证方法

4.1薄膜过滤法

试验组：将规定量的供试品按薄膜过滤法滤过，冲洗，再最后一次冲洗中加入小于100cfu的试验菌，滤过，加培养基培养。

菌液组：取同体积培养基，加试验菌，培养。

 各试验菌同法操作，按规定温度培养3~5天。

结果判断：试验组、菌液组均生长良好，则按此检查法和检验条件可进行供试品的无菌检查。如试验组中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验条件下有抑菌作用，处理方法：

①增加冲洗量、冲洗次数或更换冲洗液的种类。

②增加培养基的量。

③添加中和剂或灭活剂。

④更换滤膜品种。

消除抑菌作用，重新验证。

4.2直接接种法

     准备：8管适宜装量的硫乙醇酸盐流体培养基

           4管适宜装量的改良马丁培养基；

           无菌接种器具等

          注：培养基的装量根据供试品的性状和供试品的装量而定，具体见药典。

      整个试验分试验组和菌液组，方法流程如下：

             取适量适合的培养基12管

    分别接入小于100cfu的试验菌，每菌接2管

菌液组                    试验组

6菌各1管               6菌各1管接入规定量供试品

按规定温度培养3~5天

结果判断：试验组、菌液组均生长良好，则按此检查法和检验条件可进行供试品的无菌检查。否则，应消除抑菌作用，重新验证。若供试品性状允许，应采用薄膜过滤法，除抑菌成分方法同4.1①②③④。

4.3讨论：

a、供试品的量照无菌检查法检验量，表2，表3所示。

b、菌液浓度应预先计数或试验同时计数，以确保选择适宜稀释级的菌悬液。

c、薄膜过滤法冲洗量和冲洗次数以试验组检出为准，但不宜过大，冲洗的流数不宜过快。

d、方法验证试验可以与供试品的无菌检查同时进行。

e、无菌试验若需要使用表面活性剂、灭菌剂、中和剂等试剂，应证明其有效性且对微生物生长及存活无影响。

桂林西瓜霜微生物限度检查法的验证

一、目的

建立该产品的菌落技术方法，并对其有效性进行评价。

二、供试品

桂林西瓜霜（规格：2.5/瓶，批号：20030414、20030415、20030416）

三、培养基

  采用符合中国药典规定的干燥培养基，中国药品生物制品检定所制。

四、菌液的制备

(1)大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC(B) 44102] ；

(2)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]；

(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]；

(4)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001] ；

(5)黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]；

上述菌种采用药典提供的方法制备菌液。

五、方法及结果

（一）常规平皿法

（1）供试液的制备：取每批供试品各10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液。验证实验的3次平行试验，其试验组分别采用上述3批供试品。

（2）试验组

 A、准备10个培养皿，两个做好各相应菌种的记号。

B、取一批供试液1ml注皿，加入1ml稀释至适宜浓度的菌液，立即倾注相应得培养基，平行制备二个平皿，置规定温度培养规定时间，点计菌落数。

（3）菌液组：按平皿菌落计数法测定加入的5种菌液的实际浓度。

（4）供试品组：取规定量供试品溶液，按菌落计数方法测定本底菌落数。

（5）稀释剂对照组：稀释剂100ml，加入对照菌液适量，振摇，分别注入1ml，立即倾注培养基，每菌作２个平皿，置规定温度培养规定时间，计菌落数。

结果：

试验次数

菌落计数结果

回收率％菌液组（上）

稀释剂对照组（下）

试验组（cfu/皿）

菌液组（cfu/皿）

供试品

组

稀释剂对照组（cfu/皿）

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

１

56

0

0

0

84

124

140

105

124

90

０

100

130

138

110

86

45

0

0

0

93

81

94

100

89

96

２

66

0

0

0

85

134

132

110

110

93

０

117

128

143

101

89

49

0

0

0

91

87

97

100

100

96

３

61

0

0

0

73

130

130

121

104

86

０

94

120

133

97

85

47

0

0

0

85

72

92

100

93

99

（７）评价

上述试验结果表明，桂林西瓜霜采用常规方法进行菌落计数，仅黑曲霉的记数结果的准确的，大肠杆菌有部分抑制，其他三种菌被完全抑制，常规计数法对这四种菌的计数结果是无效的。

针对上述结果，应考虑重新建立菌落计数的方法。拟采用培养基稀释法。

（二）培养基稀释法

（１）   供试液的制备同常规法。

（２）   试验组：

a、  确定稀释法的接种量：本次验证实验将１ml 供试液分成５等分，即每皿接踵０.２ml

b、  准备２５个平皿，分成５组，每组５个平皿，分别做好各相应菌种的标记

c、  用微量移液器吸取供试液各０.２ml，注入上述平皿中，加入１ml稀释至适宜浓度的菌液，立即倾注相应的培养基，置规定温度培养规定时间，点计菌落数

（３）   菌液组：按平皿菌落数计数法测定假如地种菌液的实际浓度

（４）   供试液对照组：取规定量供试品溶液，按培养基稀释法测定供试品本底菌数

（５）稀释剂对照组：稀释剂100ml，加入对照菌液适量，振摇，分别注入1ml，立即倾注培养基，每菌作二个平皿，置规定温度培养规定时间，点计菌落数。

（６）结果

试验次数

菌落计数结果

回收率％菌液组（上）

稀释剂对照组（下）

试验组（cfu/皿）

菌液组（cfu/皿）

供试品

组

稀释剂对照组（cfu/皿）

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

１

101

11

96

88

56

140

155

117

127

64

０

128

142

98

109

59

72

7

82

81

88

91

92

84

86

92

２

98

7

110

105

63

０

70

5

94

96

98

-

-

-

-

-

３

128

13

100

92

58

０

91

8

94

84

90

-

-

-

-

-

（７）评价

　　　上述实验结果证明，桂林西瓜霜采用培养基稀释法进行菌落计数，大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的计数结果是准确的，金黄色葡萄球菌几乎被完全抑制，培养基稀释法对该菌的计数结果是无效的

针对上述结果，应考虑重新建立菌落计数的方法

拟采用离心法和培养基稀释法联用的方法

（三）离心法——培养基稀释法联用

（１）供试液制备：同常规方法。取供试液１０ml置离心管内，５００rmp离心５min，小心吸取上清液，置另一支离心管内，３０００rpm离心３０min，弃取上层液，保留离心管底部２ml供试液

（２）试验组：

a．                 确定稀释法的接种量：本次验证实验将１ml供试液分成５等分，即每皿接种０.２ml

b．                 准备５个平皿做好金黄色葡萄球菌的标记

c．                 用微量移液器吸取供试液各０.２ml，注入上述平皿中，加入１ml稀释至适宜浓度的菌液，立即倾注营养琼脂培养基，置规定温度培养规定时间，点计菌落数

（３）菌液组：按平皿菌落计数法测定加入的金黄色葡萄球菌菌液的实际浓度

（４）供试品对照组：取规定量供试平溶液，按离心法——培养基稀释法联用测定供试品本底菌数

（５）稀释剂对照组：本品为粉状固体，制备供试液时需采用稀释剂分散，应设置该组。

分别取稀释剂１００ml，加入金黄色葡萄球菌对照液适量（一般应加入１０的负５次方稀释级的菌液１ml），按（１）供试液制备的方法振摇。用取此液１０ml置离心管内，５００rmp离心５min，小心吸取上清液，置另一支离心管内，３０００rpm离心３０min，弃取上层液，保留离心管底部２ml残液。

（５）   用微量移液器吸取该稀释剂０.２ml注皿，做５个平皿，立即倾注相应的培养基，置规定温度培养规定时间，点计菌落数

（６）结果

试验

次数

菌落计数结果

回收率

（％）

试验组

菌液组

供试品组

稀释剂对照组

１

102

135

0

98

75

２

119

0

88

３

97

0

72

（７）评价

上述实验结果证明，桂林西瓜霜采用离心法——培养基稀释法联用进行菌落计数，５种菌均能有效计数

六、结论

针对上述结果，制订的菌数计数方法为：

取供试品１０g，加ＰＨ７.０无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至１００ml，制成１：１０的供试液，取供试液１０ml置离心管内，５００rmp离心５min，小心吸取上清液，置另一支离心管内，３０００rpm离心３０min，弃取上层液，保留离心管底部２ml供试液。用微量移液器吸取该稀释剂０.２ml注皿，做５个平皿，立即倾注相应的培养基，置规定温度培养规定时间，点计菌落数

虎杖苷注射液无菌检查的方法验证

1. 样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司提供，批号20040305。

2. 培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，批号040203；改良马丁液体培养基，批号040302； 营养肉汤培养基，批号0403045；营养琼脂培养基，批号040513；0.1%蛋白胨溶液，批号050217；玫瑰红钠琼脂培养基，批号040202；由中检所所培养基室提供。

3. 方法：中国药典2005版无菌检查中薄膜过滤法方法验证   

4. 验证试验用菌种：验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞菌（10104）、枯草芽孢杆菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（98003），来自中国医学细菌保藏中心。

5. 菌液制备：

取经34℃­培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10^－5～10^－7约为50～100cfu/ml备用。

取经24℃­培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10^－5约为50～100cfu/ml备用。

取经34℃­­培养18～24小时的生孢梭菌硫已醇酸盐液体培养物1ml ，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10^－7备用。

取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10^－4约为50～100cfu/ml备用。

6. 供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋白胨溶液30 ml溶解后，过滤。

7. 活菌计数    活菌计数结果见表1。

表1    活菌计数（cfu/ml）

10^－4稀释

10^－5稀释

10^－7稀释

1

2

1

2

1

2

金黄色葡萄球菌

56

60

枯草芽孢杆菌

77

79

白色念珠菌

86

70

黑曲霉菌

80

76

铜绿假单胞菌

47

50

8 方法验证

直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支改良马丁液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），即上述菌液1ml，其中4支硫乙醇酸盐培养基和2支改良马丁培养基中个加入供试品2ml，置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。

薄膜过滤法：取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（3联筒/套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲洗500ml后，再分别接入金黄色葡萄球菌、枯草杆菌50~100个/筒即可，同时平行做稀释剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性菌的验证滤筒置37℃­培养3～5d，逐日观察，结果见表1、2、3。

表2 虎杖苷注射液无菌检查法验证（直接接种法）试验组

   菌株

             次数

                  管数

培养基

硫乙醇酸盐                 霉菌

  1   2   3   4   5  (d） 1   2   3   4   5

金黄色葡萄球菌

1

1

2

-   -   -   -   -

-   -   -   -   -

2

1

 2

-   -   -   -   -

-   -   -   -   -

3

1

 2

-   -   -   -   -

-   -   -   -   -

白色念株菌

1

 1

 2

                           -   +   +   +   +

                           -   +   +   +   +

2

1

2

                           -   +   +   +   +

                           -   +   +   +   +

3

1

2

                           -   +   +   +   +

                           -   +   +   +   +

枯草杆菌

1`

1

2

-   -   -   -   -

-   -   -   -   -

2

1

2

 -   -   -   -   -

 -   -   -   -   -

3

1

2

 -   -   -   -   -

 -   -   -   -   -

黑曲霉

1

1

2

                           -   +   +   +   +

                           -   +   +   +   +

2

1

2

                           -   +   +   +   +

                           -   +   +   +   +

3

1

2

                           -   +   +   +   +

                           -   +   +   +   +

铜绿假单胞菌

1

1

2

 +   +   +   +   +

     +   +   +   +   +

2

1

2

+   +   +   +   +

 +   +   +   +   +

3

1

2

+   +   +   +   +

+   +   +   +   +

生孢梭菌

1

1

2

+   +   +   +   +

+   +   +   +   +

2

1

2

+   +   +   +   +

+   +   +   +   +

3

1

2

  +   +   +   +   +

+   +   +   +   +

表3  薄膜过滤法人工接入金黄色葡萄球菌（活菌数58cfu）

硫乙醇酸盐液体培养基（100ml/滤器）

实验次数

培养1d

培养2d

培养3d

培养4d

培养5d

1（冲洗量500 ml）

+

+

+

+

+

2（冲洗量500 ml）

+

+

+

+

+

阴性对照（50 ml）

-

-

-

-

-

表4  薄膜过滤法人工接入枯草杆菌（活菌数78cfu）

硫乙醇酸盐液体培养基（100ml/滤器）

实验次数

培养1d

培养2d

培养3d

培养4d

培养5d

1（冲洗量500 ml）

+

+

+

+

+

2（冲洗量500 ml）

+

+

+

+

+

阴性对照（50 ml）

-

-

-

-

-

9 结论：根据上述结果，由于采用直接接种法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检查应依据中国药典无菌检查方法中的薄膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。

三、实验环境的验证

实验室布局的技术要点

１.合理的人流、物流

２合理的洁净度级别

３合理的污染控制流程

无菌室的使用和维护

１　应注意空调机组的设计寿命，对机组中的易损部件应定期监控

２　应合理使用消毒手段，可考虑臭氧、过氧化氢等气体消毒技术

３　应严格按程序进行微生物实验的操作，避免人为污染

４　应避免在无菌室内放置不必要的用品，以防污染

无菌室性能的确认

１　与无菌室性能相关的主要指标：洁净度、微生物数、换气次数、压差

２　洁净度：可采用激光粒子计数器对无菌室的实验空间进行监控，监控频率可根据实验室的使用频率确定，理想的状态是每次实验后。

３　微生物数：可采用空气浮游微生物采样器对无菌室的实验空间进行监控，理想的监控频率应与洁净度相同。

4、换气次数：该指标表示某洁净空间达到预期洁净度的能力，可通过风量测定进行换算。

5、压差：该指标能指示各洁净空间之间的气流关系，对污染控制有实际意义，可通过压差仪进行实时监控。

无菌室的其他性能指标：

1、温湿度：对试验人员的环境耐受力有影响.

2、照度：对采光不良的无菌室有意义.

3、新风量：应定期监控新风口的风量，确保无菌室内的新风量能达到总风量的25%~30%。

2005版药典规定的试验室环境验证内容：

1、验证的项目：洁净度和微生物数

2、验证的频率：未作规定，建议每二周一次。

3、验证的标准：现行版国家标准，目前的标准为GB/T16292-16294-1996。

4、验证报告应至少包括：洁净度和微生物数的具体数据、对被测无菌室是否达到标准的评价。

四、灭菌程序的验证

灭菌程序验证的一般概念

1、通俗地讲就是灭菌器设置的各项参数，包括灭菌方法的选择、被灭菌物品的容器体积、灭菌器的装载方式、灭菌器的温度以及持续时间等。

2、进行程序验证的目的在于确保物品的灭菌质量，使灭菌的过程处于可控的状态。

3、药典要求的灭菌程序验证主要是对热力灭菌程序的验证。

灭菌验证内容包括：

1、撰写验证方案及制定评估标准。

2、确认灭菌设备技术资料齐全、安装正确，并能处于正常运行（安装确认）。

3、确认关键控制设备和仪表能在规定的参数范围内正常运行（运行确认）。

4、采用被灭菌物品或模拟物品进行重复验证，确认灭菌效果符合规定（性能确认）。

5、汇总并完善各种文件和记录，撰写验证报告。

灭菌程序验证的准备

1、确认被验证程序的各项参数；

2、对灭菌器进行运行确认，确认各项参数能顺利达到；

3、根据灭菌方法的不同，合理选择生物指示剂；

4、确认生物指示剂的孢子农度；

5、选择灭菌器的装载方式；

6、确认生物指示剂的放置位置。

例：湿热灭菌程序验证方案

1、确认被验证的灭菌程序为121℃，20分钟。

2、对蒸汽灭菌进行运行确认，温度和时间控制符合要求。

3、购置嗜热脂肪肝菌生物指示剂，根据被验证的灭菌程序的要求，应选择合理的F₀  值。

4、对微生物指示剂的孢子数进行确认，一般应达到5×10⁶个/瓶。

5、对湿热灭菌程序可选择满载方式，也可以选择半载方式，一般首次验证可考虑满载方式。

6、确认被灭菌物品的最大容器体积，一般为1000ml锥形瓶。

7、生物指示剂应妥善放置于最大容器的中心点。

8、在灭菌器内应均匀分布各指示剂，且冷点处至少放置一份。

9、开启灭菌器，使之达到设定的参数值。

10、灭菌结束后，取出指示剂，置规定温度培养，一般为56~60℃培养24~48小时。同时设置对照。

11、结果判断：a、所有灭菌器的指示剂经培养后，均呈培养基的本底颜色，而对照应有菌生长。

b、出现上述结果，表明该灭菌程序分布、热穿透均能达到要求，灭菌器冷点的温度亦能达到设定的值，灭菌程序验证通过。